计量检测制备好的标准系列和空白，方法选定的波长下，测定吸光度。已被测物浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制校准曲线。对标准系列，溶液以纯溶剂为参比进行测量后，应先作空白校正，然后绘制标准曲线；标准溶液一般可直接测定，但如试样的预处理较复杂致使污染或损失不可忽略时，应和试样同样处理后再测定。校准曲线的斜率常随环境温度、试剂批号和贮存时间等实验条件的改变而变动。
因此，测定试样的同时，绘制校准曲线最为理想，否则应在测定试样的同时，平行测定零浓度和中等浓度标准溶液各两份，取均值相减后与原校准曲线上的相应点核对，其相对差值根据方法精密度不得大于%%否则应重新绘制校准曲线。校准曲线的检验 线性检验:即检验校准曲线的精密度。对于以～个浓度单位所获得的测量信号值绘制的校准曲线，分光光度法一般要求其相关系数|r|≥，否则应找出原因并加以纠正，重新绘制合格的校准曲线。截距检验：即检验校准曲线的准确度，线性检验合格的基础上，对其进行线性回归，得出回归方程=+然后将所得截距与作检验，当取%置信水平，经检验无显著性差异时，可做处理，方程简化为=移项得=线性范围内，可代替查阅校准曲线，直接将样品测量信号值经空白校正后，计算出试样浓度。当与有显著性差异时，表示校准曲线的回归方程计算结果准确度不高，应找出原因予以校正后，重新绘制校准曲线并经线性检验合格。
计算回归方程，经截距检验合格后投入使用。仪器校验回归方程如不经上述检验和处理，就直接投入使用，必将给测定结果引入差值相当于解决的系统误差。斜率检验:即检验分析方法的灵敏度，方法灵敏度是随实验条件的变化而改变的完全相同的分析条件下，仅由于操作中的随机误差导致的斜率变化不应超出一定的允许范围，此范围因分析方法的精度不同而异。例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相对差值小于%而原子吸收分光光度法则要求其相对差值小于%等等。
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